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疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达的影响

2010-11-15 19:07       作者:    http://www.zzyjs.com

作者:杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群

金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松

【摘要】  目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶p85α(PI3K p85α)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型后,造模组大鼠再随机分为模型组、疏肝组、健脾组、综合组和自然恢复组等5组。治疗组分别给予相应药物灌胃,其他组给予等量蒸馏水灌胃,模型组继续高脂饮食,其余均予基础饲料喂养。治疗8周后,用3%戊巴比妥腹腔麻醉,腹主动脉取血,全自动生化仪检测血脂及肝功,稳态模型法评价胰岛素抵抗程度,光镜下观察各组肝脏病理改变,免疫组化方法检测肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达情况。结果 与模型组相比,药物治疗各组及自然恢复组肝脏脂变程度明显减轻,肝功、血脂、胰岛素抵抗均有显著改善(P<0.05或P<0.01),肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达明显减少(P<0.05)。与自然恢复组相比,药物治疗各组肝功、血脂、血糖的改善无显著差异,但肝脏脂变程度减轻,胰岛素抵抗指数明显下降(P<0.05),肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达显著降低(P<0.05)。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD有较好的治疗作用,其机制可能是与其降低肝细胞PI3K p85α的表达有关。

【关键词】  非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗 PI3K p85α 疏肝健脾方药

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是目前临床上的常见病和多发病,严重影响和威胁着人们的健康。目前认为,它是遗传环境代谢相关性疾病,与中心性肥胖、脂质代谢紊乱、2型糖尿病等代谢综合征疾病密切相关[1]。其发病尚不能以单一的机制解释,可能为多途径、多层次损伤产生的结果,胰岛素抵抗(IR)也被认为是其重要的发病基础。以往的研究发现,疏肝、健脾方药抗脂肪肝作用的效果显著[2,3]。本实验从胰岛素抵抗方面入手探讨上述方药治疗NAFLD的作用效果及其机制。

1    材料和方法

1.1    实验动物  

SPF级雄性SD大鼠65只,购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物许可证号:SCXK(粤)2005-2004,粤监证字:2007A010,体质量(200±20)g。

1.2    实验药物

柴胡疏肝散:柴胡6 g,川芎5 g,枳壳5 g,陈皮6 g,白芍5 g,香附5 g,炙甘草3 g。参苓白术散:人参15 g,白术15 g,茯苓15 g,薏苡仁9 g,砂仁6 g,山药15 g,桔梗6 g,白扁豆12 g,莲子9 g,炙甘草9 g。以上方药组成、剂量均参照方剂学[4]。上述药物均为三九制药颗粒剂,购自暨南大学附属第一医院中药房。

1.3    饲料

基础饲料购自广东省实验动物中心,高脂饲料的组成为83%基础饲料,10%猪油,5%蔗糖,1.5%胆固醇,0.5%胆盐。

1.4    实验试剂

游离脂肪酸(FFA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所,胰岛素放免试剂盒购于中国原子能科学研究院同位素研究所,PI3K p85α一抗(兔抗大鼠)及二抗工作液(羊抗兔IgG)购于武汉博士德生物技术公司。

1.5    动物分组与模型建立

大鼠正常喂养1周后,随机分为正常组(10只)、造模组(55只)。正常组给予基础饲料喂养,造模组给予高脂饲料喂养。12周后,随机抽取造模组5只,取肝组织做病理检测。鉴定造模成功后,将造模组随机分为模型组、疏肝组(柴胡疏肝散)、健脾组(参苓白术散)、综合组(柴胡疏肝散合参苓白术散)、自然恢复组,每组10只,用药组灌药剂量据《现代医学实验动物学》[5]确定,其余各组均给予等量蒸馏水灌胃,同时除模型组继续高脂饮食外,其余均予基础饲料喂养。治疗8周后,各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h,用3%戊巴比妥腹腔麻醉,经腹主动脉取血,分离血清,迅速摘取肝脏,取相同部位肝右叶组织用多聚甲醛溶液固定。

1.6    指标检测

1.6.1    生化指标    用全自动生化检测仪检测血清ALT、AST、TC、TG、LDLC、HDLC、GLU、ApoB100,用FFA检测试剂盒检测血清FFA,血清胰岛素的测定采用放射免疫法。胰岛素抵抗指数(HOMAIR)=空腹胰岛素(μU/mL)×空腹血糖(mmol/L)/22.5,计算值取自然对数变换。

1.6.2    组织病理学检查    取固定液固定的肝组织,大小约2 cm×2 cm×0.3 cm,常规石蜡包埋,切片,HE 染色,光镜下观察肝脏组织学变化。

1.6.3    肝细胞内PI3K p85α的检测    肝组织石蜡切片用免疫组化(SABC法)方法检测PI3K p85α在肝细胞中的表达及分布情况。

1.7    统计学方法
     
  计量资料以(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,PI3K p85α阳性率的比较用χ2检验及Fisher’s确切概率检验。 P<0.05有统计学意义。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。

2    结果

2.1    各组大鼠血清TC、TG、HDLC、LDLC的变化

与正常组相比,模型组TC、TG、LDLC较正常组显著升高(P<0.01),HDLC显著降低(P<0.  05);与模型组相比,各药物治疗组及自然恢复组均显著降低TC、LDLC(P<0.01)及TG(P<0.  05),升高HDLC(P<0.05),提示调整饮食结构可能对NAFLD的早期具有重要意义。见表1。

2.2    各组大鼠血清ALT、AST、FFA和ApoB100的变化

与正常组相比,模型组ALT、AST、ApoB100均显著升高(P<0.01),FFA明显增加(P<0.05);与模型组相比,药物治疗组及自然恢复组ALT、AST、FFA均显著降低(P<0.01,P<0.05);药物治疗各组ApoB100显著降低(P<0.01),提示疏肝健脾方药可能对脂质代谢具有进一步的潜在作用。见表2。

2.3    各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化
         
  与正常组比较,模型组血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高(P<0.05)。与模型组相比,各用药治疗组及自然恢复组均可显著降低血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数(P<0.05)。与自然恢复组相比,药物治疗组胰岛素、胰岛素抵抗指数均有明显降低(P<0.05),提示所造大鼠NAFLD模型存在IR。见表3。

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