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银杏叶提取物含药血清在大鼠体内药动学与药效学相关性研究

2010-11-15 18:07       作者:    http://www.zzyjs.com

作者:刘晓,汤道权,印晓星,魏雅芹,陈永刚

【摘要】目的 以银杏叶提取物对肾小球系膜细胞氧化损伤的保护作用为药效指标,研究银杏叶提取物中5种黄酮类成分(芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚及异鼠李素)的体内药动学及药效学过程的相关性。方法 大鼠静脉给药后,测定不同取血时点血清样本中5种黄酮类成分的含量,运用血清药理学方法,观察不同时间点血清样本及银杏叶提取物对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞氧化损伤的保护作用,对浓度-时间、效应-时间曲线进行相关分析,建立药动-药效结合模型。结果 银杏叶提取物含药血清对大鼠肾小球系膜细胞氧化损伤有明显保护作用,且血清中芦丁、槲皮苷、山奈酚及异鼠李素的药理效应的达峰时间(peak time,Tpeak)与药动学曲线下面积(area under the curve,AUC)的Tpeak一致。结论 银杏叶提取物体内、外均具有抗氧化作用,且效应的时效关系与血清中芦丁、槲皮苷、山奈酚及异鼠李素的时量关系呈正相关。

【关键词】  银杏叶提取物;系膜细胞;血清药理学;药动-药效结合模型

Abstract: Objective To investigate the correlation between the pharmacokinetic and pharmacodynamic processes of Ginkgo biloba extract (GBE), with the protective effect of GBE on the oxidative injury of glomerular mesangial cells as the pharmacodynamic index. Methods Following intravenous administration of GBE in rats, the drug-containing serum was obtained at different time points and each sample was divided into two portions. One portion was added into the cultured rat mesangial cells, which had been treated with 25 mmol/L glucose, for the determination of the activities of cell antioxidases by spectrophotometry. The other was used to determine the concentration of the 5 flavones (rutin, quercetrin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin). Thus the pharmacokinetics-pharmacodynamics model among concentration, time and effect was established. Furthermore, the effect of GBE was also investigated in vitro. Results Marked antioxidant effects of GBE and drug-containing serum could be demonstrated by in vitro tests. The peak time in the pharmacodynamic curves of rutin, quercetrin, kaempferol and isorhamnetin was consistent with that of the pharmacokinetic area under the curve (AUC) after intravenous administration. Conclusion The protection effect of the GBE-containing serum had positive time-effect and time concentration correlations with the AUC of rutin, quercetrin, kaempferol, and isorhamnetin in serum.

Key words: Ginkgo biloba extract; mesangial cells; serum pharmacology; pharmacokinetics-pharmacodynamics model

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶,银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)是经现代工艺从银杏叶中提取的活性物质,主要活性化学成分为两大类:黄酮类及萜类。黄酮类成分包括单黄酮、黄酮醇苷、乙酰化黄酮醇苷、双黄酮、黄烷-3-醇类以及原花色素等,其中黄酮醇苷在银杏叶中含量最丰富,大部分黄酮醇苷结构已经通过其水解后的苷元如槲皮素、山奈酚、异鼠李素等得到证实[1]。银杏叶提取物中另一类重要成分是萜类银杏内酯,目前已经证实结构的有银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯。中国古代即用银杏治疗哮喘、支气管炎等呼吸系统疾病,现代药理研究表明GBE中黄酮类成分具有清除自由基、抗氧化等药理作用,银杏内酯类成分具有抑制血小板活化因子及炎症分泌物的作用。另有研究报道银杏叶提取物可用于阿尔茨海默病、抑郁症、糖尿病、神经疾病、阳痿、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、耳鸣等疾病的治疗[2-5]。

大量文献报道:GBE尚具有显著的防治糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的作用[6-9],氧化应激状态的异常是DN发病的重要因素。由于GBE在动物体内的药动学(pharmacokinetics,PK)非常复杂,因此,进行GBE的药效学(pharmacodynamics,PD)、PK相关性研究,对于阐明GBE及其制剂的作用机制以及临床合理用药具有重要意义。目前,尚未见这方面的研究报道。

本实验采用血清药理学方法,通过观察正常大鼠静脉给药后不同时间点的含药血清对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)的抗氧化作用,获得PD参数;同步监测血清样本中芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚及异鼠李素的浓度变化,获得PK参数。进而对PD、PK参数进行相关性分析,建立上述5种黄酮类成分的PK-PD 结合模型,探寻GBE防治DN的物质基础。

1 材料和方法

1.1 动物 SD大鼠,SPF级,体重(220±10) g,雌雄各半,由徐州医学院实验动物中心提供(SYXK(苏)2001-0050)。

1.2 试剂与药品 GBE(批号20060312,江苏恩华药业有限公司),芦丁(100080-200306)、槲皮苷(111538-200302)、槲皮素(100081-200406)、山奈酚(110861-200606)、异鼠李素(110860-200407)均购自中国药品生物制品检定所,DMEM (with D-glucose at 25 mmol/L,Gibco公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶(批号27250018,Gibco公司),SOD、MDA测试盒(南京建成生物工程研究所),HBZT-1大鼠肾小球系膜细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心),甲醇(色谱纯,美国Fisher Scientific 公司);其余试剂为分析纯。

1.3 仪器 Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津制作所),包括SCL-10Avp系统控制器、SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-10ADvp两元泵、SIL-20A自动进样器、FCV-10Alvp四元低压梯度洗脱系统、DGU-20As在线脱气机、岛津Lcsolution 色谱数据工作站;梅特勒托利多AE240电子天平(十万分之一,瑞士Mettler Toledo);CO2培养箱(class 100,美国Sheldon公司);台式高速冷冻离心机(5417R,德国Eppendorf公司);医用净化工作台(XYJ-1450D,苏州净化设备公司);-70℃超低温冰箱(美国Form公司);倒置显微镜(CK40,日本OLYMPUS公司);酶标仪(128ce,澳大利亚Clinibio公司)。

1.4 GBE注射液的制备 精密称取GBE适量置50 ml容量瓶中,用30% PEG-400生理溶液溶解并稀释至刻度,配成20 g/L的GBE溶液,0.22 μm滤膜过滤,灌封,煮沸灭菌法灭菌,备用。

1.5 血清样品的制备 取SD大鼠54只,按体重随机分成9组,每组6只,雌雄各半。每组大鼠均静脉给予40 mg/kg GBE,各组分别于给药前及给药后1、2、3、5、10、15、30、60、90、120、180和240 min尾静脉取血,一部分血浆3000 r/min离心10 min,分离血清,-20℃保存备用(含量测定用)。另取一部分血浆离心后无菌分离血清,同组血清合并后56℃水浴30 min灭活,0.22 μm微孔滤膜过滤,-70℃冰箱保存备用(药效学实验用)。

1.6 血清样品高效液相色谱分析条件 色谱柱为Agilient Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温35℃,检测波长360 nm,进样量20 μl,流速1.0 ml/min。流动相:A为甲醇,B为0.1%甲酸水溶液。线性梯度洗脱,洗脱程序如下:0~5 min,70%~65% B;5~40 min,65%~60% B;40~50 min,60%~55% B;50~70 min,55%~50% B。

1.7 大鼠血清中5种黄酮类成分的药时曲线 取不同时间点大鼠血清0.1 ml,加入丙酮-乙醚(1∶14,体积比)0.5 ml,涡旋2 min后,4000 r/min离心10 min,分离上清液得溶液Ⅰ,残留物加入甲醇0.5 ml,涡旋2 min后,4000 r/min离心10 min,分离上清液得溶液Ⅱ,合并溶液Ⅰ和Ⅱ,40℃水浴,N2吹干。残渣加入100 μl甲醇-0.1%甲酸(80∶20,体积比)溶解,14000 r/min离心15 min,取上清液20 μl,在“1.6”项色谱条件下注入高效液相色谱仪中分析。

1.8 MC的培养、实验、测定 将肾小球MC置于37℃、5% CO2气体培养箱中培养。倒置显微镜观察细胞处于80%~90%汇合阶段进行传代,一般3天传代1次。吸除培养瓶内培养液,PBS洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶3 ml。室温下,倒置显微镜下观察细胞回缩至近圆形尚未脱落时,立即终止消化。吸除胰蛋白酶液,先以DMEM低糖培养液5 ml冲洗1次,再加入该培养液10 ml,用吸管轻轻吹打瓶壁细胞,使之脱离瓶壁形成细胞悬液,分成等份装入培养瓶中,一般1∶3或1∶4传代。

取对数生长期的肾小球MC,以1×109/L的密度按一定体积接种于96孔板内。常规培养24 h后弃去培养基,各组分别加入经0.22 μm滤膜过滤灭菌的相应血清40 μl,剩余体积用含10%小牛血清的DMEM培养基补齐,每孔终体积为200 μl,每组设6个平行孔。细胞分组方法见表1。 表1 MC细胞分组

各组细胞常规培养48 h后,消化至单个细胞,调整成细胞数为1×109/L的细胞悬液。收集各组细胞,1000 r/min离心3 min,PBS洗涤3次。弃去上清,用4℃ PBS 400 μl吹打成细胞悬液,冰浴超声破碎细胞,得样品裂解液。按试剂盒操作说明分别对各组样品裂解液进行总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)测定。

1.9 含药血清抗氧化曲线与血清中5种黄酮类成分时量曲线的相关性分析 分别将芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚及异鼠李素的浓度-时间曲线在各个时间段的曲线下面积AUCt2t1值作为X1、X2、…、X11、X12,而将含药血清抗氧化效应的MDA及SOD值计为Y1、Y2、…、Y11、Y12作图。

1.10 统计学处理 数据用±s表示,经Excel处理,计算药代动力学参数,两组间比较用t检验,P<0.05有统计数意义。

2 结 果

2.1 标准曲线 在本实验条件下,5种黄酮类成分均有较强的色谱峰和较好的分离度。血浆中杂质峰不干扰样品的测定,基线噪音小,方法回收率、精密度等均符合生物样品检测要求。

取空白血浆0.1 ml,精密加入10 μl不同浓度的芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚及异鼠李素标准品,使其含芦丁浓度为:0.126、0.253、0.505、1.01、2.53、5.05、10.1、20.2 mg/L,槲皮苷浓度为 0.121、0.242、0.483、1.208、2.415、4.83、9.66、19.32 mg/L,槲皮素浓度为0.1008、0.252、0.504、1.008、2.52、5.04、10.08、20.16 mg/L,山奈酚浓度为0.062、0.123、0.246、0.308、0.615、1.23、2.46、5.92 mg/L,异鼠李素浓度为0.098、0.196、0.392、0.98、1.96、3.92、7.84 mg/L。在“1.6”项色谱条件下进样分析,记录峰面积。重复进样多次(n=5)。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,建立回归方程,得芦丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚及异鼠李素的回归方程分别为Y=9181X-23.51(r=0.9995)、Y=11276X-440.88(r=0.9999)、Y=41571X-3742.1(r=0.9977)、Y=39793X-592.53(r=0.9990)及Y=25563X+35.203(r=0.9995)。

2.2 大鼠静脉给予GBE后血清中5种黄酮类成分的经时变化 以5种黄酮类成分的峰面积分别按标准曲线方程计算求得大鼠静脉给予GBE后血清中不同时间点5种黄酮类成分在血清中的浓度,根据不同时间点的浓度计算AUCt2t1,结果见表2及表3。

2.3 大鼠静脉给予GBE后不同时间含药血清对MC中T-SOD及MDA含量的影响 大鼠静脉给予GBE后不同时间点的含药血清的药效学测定结果见表4,由表中结果可以看出,与高糖组比较,给药后各时间点的含药血清均可使MC中T-SOD含量显著升高、MDA含量降低(P<0.01),提示其具有显著抗氧化作用,其中60 min的含药血清抗氧化效果最好。与高糖组比较,GBE可使MC中T-SOD含量显著升高、MDA含量降低,从而发挥显著抗氧化作用(P<0.01)。

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